Infecțiile cu virus aripa deformată au efecte dăunătoare pe termen lung asupra hrănirii și supraviețuirii albinelor
Kristof Benaets , Anneleen Van Geystelen , Dries Cardoen , Lina De Smet , Dirk C. de Graaf , Liliane Schoofs , Maarten HD Larmuseau , Laura E. Brettell , Stephen J. Martin , Tom Wenseleers
Publicat 1 februarie 2017 . DOI: 10.1098 / rspb.2016.2149
Articol
Cifre Și Date
Info & Metrici
eLetters
 PDF
Abstract

Mai multe studii au sugerat că stresorii sub acoperire pot contribui la declinul coloniilor de albine. Aici oferim un studiu de caz și arată că tehnologia de urmărire a identificării radiofrecvenței care acoperă infecțiile de devieri de la aripile deformate (DWV) la lucrătorii adulți de albine influențează în mod serios hrănirea pe termen lung și supraviețuirea în condiții de hrană naturală. În special, experimentele noastre arată că lucrătorii adulți injectați cu doze mici de DWV au înregistrat rate de mortalitate crescute, că DWV a provocat muncitorii să înceapă hrănirea la o vârstă prematură și că virusul a redus durata totală a activității lucrătorilor ca forage. În ansamblu, aceste rezultate demonstrează că infecțiile sub acoperire DWV au efecte puternice asupra creșterii și supraviețuirii albinelor. Aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile anterioare, care sugerează că DWV este un factor important în declinul albinelor în curs de desfășurare din Europa și din SUA. În ansamblu, studiul nostru subliniază impactul puternic pe care îl pot avea infecțiile patogene sub acoperire asupra performanțelor individuale și la nivel de grup în albine.

1. Introducere

Pe parcursul ultimelor decenii, scaderi serioase in ambele polenizatori de albine sălbatice și gestionate au fost înregistrate în multe părți ale lumii [ de 1 - de 5 ], amenințând astfel serviciile ecosistemice pe care le oferă. Cauza principală a recentelor valuri de pierderi de colonii de albine a fost supusă unei dezbateri și actualul consens este că stresorii multipli contribuie probabil la aceste scăderi, incluzând malnutriția datorată lipsei diversității florilor, expunerii la agrochimie sau răspândirii agenților patogeni emergenți și paraziții [ 2 , 5 - 10 ]. Identificarea acestor factori de stres poate fi totuși dificilă, mai ales atunci când efectul lor devine evident doar pe perioade lungi de timp, cum ar fi expunerea la doze subletale de pesticide [ 9 , 11 ] sau după contractarea unor infecții patogene aparent inofensive [ 12 , 13 ].

Printre agenții patogeni, studii recente au sugerat că virusul aripii deformate (DWV) reprezintă un important factor de stres pe termen lung, așa cum a fost asociat statistic cu atât mortalitatea de iarnă și colapsul coloniei în multe studii [ 14 - 24 ]. DWV are o distribuție aproape globală și este cel mai răspândit dintre virusurile descrise în prezent, care infectează albinele, care afectează adesea între 50% și 75% din totalul stupilor de albine [ 25 , 26 ]. În plus, virusul se poate extinde asupra altor albine [ 27 , 28 ], prezentând astfel o amenințare suplimentară. DWV este numit după deformarea aripilor caracteristice care pot apărea atunci când albinele melifere sunt infectate în stadiul larvar sau pupelor prin intermediul vectorului acarianul ectoparazite Varroa destructor [ 29 ]. În acest caz, infecțiile virale au ca rezultat abdomenul umflat, mizeria și scurtarea duratei de viață [ 29 ]. În mod obișnuit, totuși, infecțiile iau o formă mai "sub acoperire", ceea ce nu dă naștere unor simptome morfologice vizibile, în special atunci când infecția are loc în stadiul adult sau când acarienii au doar titruri mici de virus. Cu toate acestea, faptul ca coloniile cu infecții ascunse pot suferi de slăbiciune, depopulare și prăbușirea bruscă [ 22 ] și că prezența virusului a fost legată atât cu mortalitatea de iarnă și colapsul coloniei [ pe 14 - deschisă 24 ] sugerează că DWV exercită o cantitate semnificativă de stres pe termen lung.

Într-adevăr, mai multe studii recente care utilizează o infecție artificială controlată a lucrătorilor adulți de albine au arătat o serie de efecte importante ale DWV, incluzând afectarea sensibilității senzoriale, învățarea asociativă olfactivă și formarea memoriei [ 30 ] (eventual legată de replicarea virusului în ciupercă organisme și lobi antena [ 31 ]), ritmul accelerat al tranziției comportamentale prin alocarea sarcinilor legate de vârstă [ 32 ] și reducerea duratei de viață a albinelor adulte infectate [ 25 ]. Mai mult, două studii în care variația naturală a nivelurilor de infecție a DWV a fost combinată cu variația manipulată experimental la nivelele de infectare cu Nosema parazit microsporidian a arătat că albinele infectate cu DWV au prezentat distanțe de zbor scurtate și durate de zbor în experimentele fabricației de zbor [ 33 ] diferențele în comportamentul de zbor în orientare într-un set de urmărire armonică a radarului [ 34 ], în timp ce modelul invers a fost observat pentru Nosema [ 33 , 34 ]. Cu toate acestea, totuși, efectele DWV asupra comportamentului de zbor al albinelor și a tiparelor de hrănire nu au fost încă investigate utilizând seturi controlate de infectare.

Scopul acestui studiu a fost, prin urmare, acela de a determina impactul DWV ca stresor pe termen lung în albine și de a testa experimental dacă inocularea albinelor adulte cu virusul a afectat în mod negativ comportamentul și performanța de hrănire a albinelor. În acest scop, am utilizat etichetele cu transponder de identificare prin radiofrecvență (RFID) [ 9 , 11 , 35 - 40 ] ca o tehnologie-cheie care ne-a permis să monitorizăm neinvaziv activitatea de ieșire de hive pe termen lung a lucrătorilor de albine care au fost sau nu au fost infectați experimental cu virusul. Urmărirea activității în afara stupilor este esențială în studiile privind impactul agenților patogeni asupra sănătății albinelor, deoarece forța de hrănire a muncitorilor este responsabilă de toate achizițiile de resurse, iar gama de hrană pentru hrană, activitatea muncitorilor și amploarea fluxului de resurse sunt vitale pentru creșterea și supraviețuirea coloniilor [ 41 , 42 ]. Anterior, tehnologia RFID a fost utilizată cu succes pentru a studia efectele subletale ale stresului nutrițional și pesticidelor asupra albinelor și bumblebee comportament foraging [ 9 , 11 , de 35 - de 40 ]. Cu toate acestea, aplicațiile studiului stresului indus de agenții patogeni asupra comportamentului de hrănire a albinelor sunt încă rare și în prezent se limitează la un studiu privind virusul paraliziei israeliene (IAPV) [ 43 ], care a documentat diferențele induse de virus în ceea ce privește capacitatea de hrănire, profitând de tehnologia pentru a studia impactul pe termen lung asupra comportamentului de hrănire și un studiu care a arătat efectele adverse ale unui parazit intestinal microsporidian, Nosema apis , asupra hranei albinelor și supraviețuirii [ 44 ]. În plus, o altă tehnologie de urmărire-radar armonic a fost recent utilizată de un grup pentru a arăta că patogenul Nosema ceranae a provocat un comportament de deplasare negativ în albine [ 45 ] și că infecția cu Nosema a afectat, de asemenea, comportamentul zborului orientat spre albine [ 34 ]. Metoda de urmărire, totuși, nu a putut releva nici o corelație între nivelurile de infectare cu DWV și caracteristica de zbor orientare [ 34 ].

2. Material și metode

(a) Setarea de urmărire a identificării prin radiofrecvență

Trei stupine de observare cu trei cadre cu albine de Apis mellifera carnica au fost instalate la vierul laboratorului din Leuven, Belgia, pentru a servi drept colonii gazdă pentru albine marcate cu RFID care au fost sau nu au fost infectate experimental cu DWV (400 de condiții de tratament per colonia gazdă, Vezi mai jos). Fiecare colonie gazdă a conținut două cadre de puiet, un cadru cu polen și miere stocate, o regină și aproximativ 3000 de lucrători ai coloniilor gazdă ( figura 1 ). Coloniile au fost plasate în interior la temperatura camerei și au fost conectate la exterior printr-un singur tunel de intrare pentru a permite hrănirea liberă. Capătul tunelului a fost echipat cu două IID ® MAJA module reader 4.1 RFID plasate în serie și conectate la un calculator MAJA 4.1 gazdă (Microsensys, Germania) pentru a înregistra și log calendarul tuturor albinelor marcate RFID care ies sau intră în stup. Prin configurarea modulelor cititoarelor într-o configurație serioasă, semnalele succesive de la ambii cititori au furnizat informații privind direcția de mișcare a albinelor detectate. Cititorii au fost separați unul de altul printr-un bloc de tunel de lemn de 4 cm pentru a preveni interferența dintre cititoare ( figura 1 ).

Figura 1.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 1.
Setare experimentala. Stingile de observare au fost instalate în interior cu două cititoare RFID la intrarea stupului pentru detectarea și înregistrarea albinelor marcate cu RFID care intră sau ies din stup. Cele două module de cititoare RFID, conectate la computerul gazdă, au fost plasate în serie pentru a determina direcția de mers pe jos a albinelor detectate. Etichetele albinelor care au fost sau nu au fost infectate experimental cu virusul aripii deformate au fost introduse în colonia gazdă prin cuști de introducere separate prezentate în partea superioară ( n = 400 albine pe tratament și colonie gazdă). (Versiune online în culori.)
(b) Introducerea albinelor de control și infectate experimental

În fiecare dintre coloniile gazdă, am introdus 400 de albine de control DWV-negativ și 400 de albine DWV de albine pozitive. Acest lucru sa făcut prin faptul că a permis albinelor să iasă dintr-o singură colonie de donatori care, pe baza unui ecran anterior, a fost confirmată ca fiind lipsită de DWV, precum și de oricare dintre majorii virusi sau agenți patogeni cunoscuți [ 46 ], injectând lucrătorii nou- soluții și introducerea acestor albine într-una din cele trei colonii gazdă (a se vedea Metodele materiale electronice suplimentare pentru detalii). Toate coloniile din studiul nostru, inclusiv coloniile donatoare și gazde, au fost tratate cu Thymovar pentru controlul Varroa conform recomandărilor producătorului. Faptul că în experimentele noastre a fost folosită doar o singură colonie de donatori a fost legată de dificultatea de a găsi o colonie gazdă care nu conținea majoritatea agenților patogeni cunoscuți, dar proiectul nostru experimental a compensat parțial acest lucru prin încorporarea replicării în diferite medii gazdă. Albinele au fost lăsate să pătrundă prin plasarea cadavrelor de colonie donatoare într-un incubator MIR-253 (Sanyo, Belgia) la 34 ° C și umiditate 60%, după care lucrătorii nou-detașați au fost colectați zilnic. Ulterior, 400 de lucrători nou-concediați pentru fiecare condiție de tratament și colonie gazdă au fost injectați cu 3 pl de soluție adecvată de tratament, utilizând o seringă Hamilton de 5 μl de calibru de 26 s inserată în partea apicală a toracelui. Imediat după aceea, fiecare dintre aceste albine au fost echipat cu un mic3 ® 64-bit read-only transponder RFID (Microsensys, Germania) , prin lipire tag - ul pentru a toracele albinei folosind Kombi Turbo adeziv cu două componente (Bison, Țările de Jos). Etichetele au fost măsurate 2,0 × 1,7 × 0,5 mm, au cântărit mai puțin de 5 mg și au fost transmise la 13,56 MHz. Codurile RFID tuturor lucrătorilor experimental manipulat, împreună cu starea de tratament, colonia gazdă și momentul introducerii, au fost adăugate la o bază de date de informații transponder prin citirea fiecare cod folosind un IID ® USB PENmini pen (Microsensys, Germania). Până la 50 de persoane etichetate supuse uneia dintre cele două condiții de tratament au fost păstrate în cuști separate de 15 × 10 × 7 cm menținute la 34 ° C și 60% umiditate și au conținut o piesă de 10 × 8 cm de pieptene și apă cu umplutură de miere, pentru a permite albinelor să se stabilească înainte de introducerea lor în coloniile gazdă ( figura 1 ). Înainte de introducere, cuștile au fost plasate în partea superioară a stupilor de observare, separate doar printr-o plasă de sârmă, pentru o perioadă de 30 de minute pentru a crește ratele de acceptare [ 47 ]. Fiecare dintre cele 400 de lucrători pentru o colonie gazdă și o condiție de tratament au fost introduse pe parcursul unei perioade de 5 zile, iar comportamentul de hrănire a fost monitorizat până la 40 de zile după introducere, în august-septembrie 2012 pentru coloniile gazdă replicate A și B și septembrie- Octombrie 2012 pentru colonia gazdă C.

(c) Infecții controlate

Pentru a obține două grupuri de albine adulte potrivite pentru vârsta adultă care au fost sau nu au fost infectate cu DWV, am injectat albinele cu lizat de albine care au fost fie infectate cu DWV (și nici unul dintre ceilalți virusi de albine comune), fie cu cea a albinelor au fost confirmate a fi virus-free (pentru detalii, a se vedea materialul suplimentar electronice). Pentru a reduce probabilitatea transmiterii orizontale de la DWV infectat cu grupul de albine neinfectate [ 48 ], am adăugat de asemenea un tratament ARN dublu catenar la lizatul nostru DWV-negativ [ 49 , 50 ] pentru a încerca să păstrăm aceste albine fără DWV , și s-a adăugat un tratament GFP-dsRNA de control în lizatul pozitiv DWV pentru a controla posibilele efecte ale injectării dsRNA străine. Cantitatea de DWV injectată a fost estimată la 1,2 × 10 4 -4,6 × 10 5 copii DWV pe albină și a avut ca scop imitarea încărcăturilor infecțiilor raportate pentru albinele cu infecții sub acoperire (1,4 × 10 3 -2,4 × 109 copii pe albină, 51 ]). Pe baza secvențializării ultra-înalte de trecere a luminii Illumina, tulpina DWV utilizată pentru inoculare a fost determinată ca aparținând varianței master DWV de tip B [ 52 ], care a fost recent descoperită a fi o tulpină emergentă, puțin mai virulentă a virusului DWV [ 25 ], care este în prezent și cea mai comună tulpină din Marea Britanie [ 25 ] (pentru detalii, consultați materialul suplimentar electronic).

Pentru a valida efectele celor două soluții de tratament, 150 de lucrători suplimentari au fost injectați cu fiecare soluție de tratament, marcată cu vopsea și introdusă într-o a patra observație. La fiecare 4 zile, 20 de persoane din fiecare tratament au fost prelevate din această colonie și au fost supuse analizei MLPA pentru a determina starea lor de infectare cu DWV [ 46 ]. Aceste analize au confirmat stabilirea infecțiilor DWV stabile la albinele inoculate cu DWV-lizat, chiar dacă există dovezi că unele albine de control s-au infectat și în etapele ulterioare ale experimentului ( figura 2 ), deși probabil la niveluri mai mici materiale electronice suplimentare pentru o discuție completă a metodelor și rezultatelor acestor analize).

Figura 2.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 2.
Rezultatele validării tratamentului. Evoluția procentului de indivizi infectați în timp în grupurile de control și de tratament cu DWV, pe baza analizei MLPA [ 46 ] din patru seturi de eșantioane zilnice de 20 de indivizi fiecare din ambele tratamente (fit și 95% CI pe baza GLM binomial cu tratament, log x + 1) durata transformată după introducerea în colonia gazdă și interacțiunea lor inclusă ca variabile independente).
(d) Analiza datelor

Datele de urmărire RFID au fost analizate cu ajutorul aplicației Track-A-Forager Java [ 53 ], care filtrează scanări succesive rapide ale aceluiași scaner, etichetează zborurile de intrare și ieșire ale lucrătorilor etichetați și corectează erorile ocazionale ale datelor, posibila apariție a scanărilor pierdute (pentru detalii, consultați materialul suplimentar electronic). Pentru a compara comportamentul de hrănire al albinelor infectate cu DWV și de control, am cuantificat numărul de excursii efectuate de fiecare individ, durata călătoriei și proporția lucrătorilor introduși din fiecare grup de tratament care au supraviețuit până la vârsta de furajare, pentru a evalua diferența timpurie a vieții mortalitate. În plus, am măsurat vârsta de la debutul căutării, definită ca vârsta fiecărui individ la prima călătorie reconstituită, speranța de viață a foragerilor, măsurată ca vârsta fiecărui individ la ultima scanare și durata activității foragerului, adică diferența de timp în zilele dintre prima și ultima scanare înregistrată a fiecărei albine. Trebuie să remarcăm că experimentul nostru nu a făcut distincția între o reducere a mortalității directe induse de DWV și o mortalitate indusă de DWV datorită efectelor indirecte, de exemplu provocată de o scădere a capacității de găzduire sau de o creștere a sensibilității la dăunător sau a altor factori de stres din mediu. Detaliile tuturor analizelor statistice efectuate sunt furnizate în materialul suplimentar electronic și în scriptul R inclus în depozitul Dryad.

3. Rezultate

Analiza vizuală a activității de hrănire pe parcursul experimentului nostru a evidențiat diferențe clare la vârsta la debutul căutării, speranța de viață proastă și durata activității foragerului între albinele infectate cu DWV și cele de control ( figura 3 ). În plus, albinele care au supraviețuit până la vârsta de furajare au prezentat o deviație clară față de raportul 50:50 la care au fost introduse pentru prima dată ( figura 3 ), albinele de control având în mod evident șanse mult mai mari să supraviețuiască până la vârsta de hrănire decât cele infectate cu DWV. Pentru a examina cu atenție fiecare dintre aceste efecte, precum și pentru a căuta alte efecte posibile ale DWV asupra comportamentului de alimentație, am efectuat o serie de analize statistice detaliate. În special, am testat efectele semnificative ale DWV asupra probabilității ca albinele să supraviețuiască vârstei de hrănire, debutul de hrană pentru animale, speranța de viață a păsărilor și durata activității, precum și numărul și durata călătoriilor de călătorii furajere efectuate de indivizi care au supraviețuit vârsta de îmbătrânire.

Figura 3.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 3.
Activitatea totală de căutare a albinelor infectate cu DWV și de control. Activitatea de hrănire zilnică pe parcursul experimentului este prezentată atât pe baza călătoriilor reconstituite ( a ), cât și a scanărilor RFID nefiltrate ( b ) pentru coloniile A (sus), B (mijloc) și C (partea inferioară) ( N = total numărul albinelor unice detectate pe tratament și colonia gazdă, n = numărul total de recolte furajere reconstruite sau evenimente de scanare pe toate albinele urmărite). Persoanele fizice, reprezentate ca rânduri în diagrama, sunt sortate după tratament, vârsta la debutul căutării și durata totală a activității. Suprareprezentarea albinelor de control între foștii observatori demonstrează că lucrătorii de control aveau șanse mai mari să supraviețuiască până la vârsta de hrană, iar analiza vizuală a datelor indică, de asemenea, discrepanțele dintre DWV și albinele de control în vîrstă la debutul căutării, speranța de viață proastă și durata activității cf. figura 4 ). (Versiune online în culori.)
(a) Efectul virusului deformat al aripii asupra probabilității ca albinele să supraviețuiască vârstei de hrănire

Reprezentarea părtinitoare a albinelor de control printre albinele care au început să se hrănească în raport cu raportul 50:50 la care au fost introduse pentru prima dată ( figura 3 ) indică faptul că albinele inoculate cu DWV au avut o mortalitate mai mare la începutul vieții lor. Acest lucru este confirmat de faptul că o proporție semnificativ mai mare de albine inoculate DWV a murit înainte de a ajunge la vârsta de hrănire decât albinele de control în fiecare din cele trei colonii gazdă (277/400 versus 244/400, 324/400 versus 266/400 și 279/400 versus 175/400; colonie binomial x tratament complet GLM factorial, z = 2,44 și p = 0,015, z = 4,61 și p = 4 × 10 -6 , z = 7,33 și p = 2 x 10 -13 ; figura 4 a ). Trebuie menționat faptul că această mortalitate include și mortalitatea de bază legată de respingerea ocazională a albinelor marcate de colonie gazdă. Pentru a controla această mortalitate de bază, am calculat și cotele relative pe care albinele le-ar supraviețui la vârsta de furajare. Acest lucru a arătat că albinele inoculate cu DWV au avut, în medie, 2,1 (se 0,19) ori cote mai mici pentru a ajunge la vârsta de furajare decât albinele de control.

Figura 4.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 4.
Efectul infecției cu DWV asupra hranei pentru albine și a supraviețuirii. Din cele 400 de albine care au fost etichetate pe tratament și colonie gazdă, o proporție semnificativ mai mică a supraviețuit până la vârsta de hrană (fiind detectată cel puțin o dată de către scanerele RFID) în grupul injectat DWV decât în ​​grupul de control (panoul a , factorul binomial complet GLM, în general p <2 × 10 -16 ,Imagine încorporatăînseamnă și 95% CLs și nivelurile de semnificație pentru fiecare colonie pe baza testelor Tukey post-hoc Wald z Tukey , prezentate cu asteriscuri). În plus, albinele care au fost infectate artificial cu DWV și care au supraviețuit până la vârsta de hrănire au început să se hrănească semnificativ mai devreme decât albinele de control neinfectate (panoul b , ANOVA full-factorial bidirecțional, p = 7 × 10-19 ,Imagine încorporatăînseamnă și 95% CLs și nivelurile de semnificație pentru fiecare colonie pe baza testelor Tukey post-hoc Wald z Tukey prezentate cu asteriscuri; numărul total de albine urmărite ca în figura 3 a ) și foragerii infectați cu DWV au avut o speranță de viață semnificativ redusă (definită ca vârstă la ultima detectare, panoul c , ANOVA, p = 0,01,Imagine încorporată) și intervalul de activitate (definit ca vârstă la ultima călătorie furajeră minus vârsta la prima excursie de hrănire, panoul d ; ANOVA, p = 0,0003,Imagine încorporată) (indică și 95% CLs și nivelurile de semnificație pentru fiecare colonie pe baza testelor Tukey post-hoc Wald z arătate cu asteriscuri; numărul total de albine urmărite și călătoriile de hrănire ca în figura 3 a ).
(b) Efectul virusului aripa deformat asupra vârstei la debutul hrănirii, speranța de viață și durata activității

De asemenea, am constatat diferențe semnificative între tratamentele infectate cu DWV și cele neinfectate la vârsta observată la debutul căutării. În special, albinele care au fost inoculate cu DWV și care au supraviețuit până la vârsta de hrănire care începe să se hrănească cu 2,31 zile înainte (se 0,73), în medie, decât albinele inoculate cu soluția de control ( figura 4b ; de tratament: p = 7 × 10-9 ;Imagine încorporatădimensiunile eșantioanelor prezentate în figura 3 a ). În plus, foragerii infectați au avut o speranță de viață care a fost redusă în medie cu 4,74 zile (se 0,20) comparativ cu albinele de control ( figura 4c ; ANOVA, efectul principal al tratamentului: p = 0,01;Imagine încorporată) și o durată totală de activitate care a fost redusă cu 2,60 zile (se 0,79) în comparație cu foragerii de control ( figura 4d ; ANOVA, efectul principal al tratamentului: p = 0,0003;Imagine încorporată; dimensiunile eșantioanelor pentru ambele sunt prezentate în figura 3 a ). Astfel, albinele infectate cu DWV au avut o speranta de viata redusa si durata de activitate, de asemenea, dupa ce au inceput sa fure, chiar daca instalarea hranei pentru animale a avut loc cu 2,3 ​​zile mai devreme in grupul infectat cu DWV decat in grupul de control. În general, debutul de hrănire (la 12-17 zile) a fost oarecum mai devreme și speranța de viață proastă mai scurtă (11-26 zile) decât cea observată la stupii maturi (debut la aproximativ trei săptămâni și speranța de viață proastă de șase săptămâni [ 47 , 54 ]). Cu toate acestea, ambele cifre au fost comparabile cu cele observate în alte studii care au utilizat o configurație comparabilă de observație (de exemplu debutul hrănire la aproximativ 10 zile și speranța de viață proastă de 14-40 de zile [ 55 ]). Această discrepanță poate fi legată de stresul indus de etichetele RFID sau de injecția în sine, deoarece este cunoscut faptul că stresul în albinele albine provoacă hrănirea precoce și scurtează durata de viață a muncitorilor [ 32 , 56 ]. Chiar și așa, ne așteptăm ca concluziile noastre să fie robuste, deoarece efectele noastre de tratament sunt toate măsurate în raport cu controlul în condiții identice.

(c) Efectul virusului deformat al aripii asupra numărului de călătorii furajere sau a duratei călătoriei

Deși infecția cu DWV a afectat, în principiu, numărul călătoriilor de hrană și durata călătoriilor efectuate de indivizi care au supraviețuit până la vârsta de hrană [ 33 ], analizele noastre statistice au arătat că nu există dovezi solide în acest sens. De exemplu, efectul tratamentului asupra numărului de deplasări efectuate a fost inconsecvent și diferit între coloniile gazdă replicate (cvasi-Poisson GLM, efectele tratamentului în coloniile A, B și C: A. z = 7,55 și p = 1 x 10 -7 , B. z = -2,49 și p = 0,04; C. z = -1,38, p = 0,42). În medie, în toate cele trei colonii, lucrătorii 5,46 călătorii pe albină pe zi (se 0,50) în grupul DWV inoculată versus 5,85 călătorii pe albină pe zi (se 0.80) , în controlul (dimensiunea eșantioanelor ca în figura 3 a ), care sunt cifre compatibile cu cele prezentate în alte studii [ 47 , 54 ]. Cu toate acestea, dat fiind faptul că infecția DWV a redus semnificativ șansele ca lucrătorii să supraviețuiască până la vârsta de hrană și că infecția DWV a redus speranța de viață și durata totală a activității foragerilor (vezi rezultatele de mai sus), este clar că DWV avea încă un efect global negativ pe numărul net de călătorii și cantitatea de hrană practicată. În mod similar, efectul asupra duratei călătoriei nu a fost consecvent în coloniile gazdă, deoarece albinele inoculate cu DWV au făcut excursii mult mai lungi decât albinele de control în colonia A (gamma GLMM, testul post-hoc Tukey, 1,86 h versus 1,22 h, se 0,17 și 0,08, p = 0,0004), în timp ce nu a existat un efect semnificativ asupra duratei călătoriei în colonia C (2,89 ore comparativ cu 2,50, se 0,41 și 0,47, p = 0,90) și o tendință opusă în colonia B decât în ​​colonia A (1,62 ore față de 1,99 h , se 0,12 și 0,27, p = 0,39). Includerea termenului sau a vârstei lucrătorului ca termeni liniari sau polinomiali explicit, fie în interacțiune cu tratamentul, fie nu, nu a îmbunătățit puterea explicativă a niciunui model montat și, prin urmare, astfel de analize nu au fost urmărite în continuare.

4. Discutie

În ansamblu, rezultatele noastre demonstrează că infecțiile cu DWV au efecte dăunătoare asupra albinelor de albine adulte, atât cu o rată a mortalității, cât și cu un comportament de alimentație mai puțin afectat în mod clar. În special, albinele infectate cu DWV au început să se hrănească la o vârstă mai înaintată și au prezentat o durată de viață redusă și o durată totală de activitate decât albinele de control. În cele din urmă, secvențarea următorului gen a demonstrat că tulpina DWV utilizată pentru inoculare aparținea variantei master DWB de tip B [ 52 ], care a fost recent descoperită a fi o tulpină emergentă, mai virulentă a virusului DWV [ 25 ] a fi cea mai frecventă tulpină din Marea Britanie [ 25 ]. Faptul că lizatul nostru DWV a fost preparat dintr-o probă selectată aleatoriu de albine cu simptome de infecție DWV evidentă sugerează că această tulpină este acum, de asemenea, obișnuită în Europa continentală.

Constatarea noastră că lucrătorii inoculați cu DWV au început să se hrănească la o vârstă mai înaintată și au experimentat așa-numita hrană precoce a fost în conformitate cu așteptările, deoarece studiile anterioare au constatat că lucrătorii de albine nesănătoase sau stresați încep să îndeplinească sarcini riscante de hrană la o vârstă mai fragedă persoane sănătoase. De exemplu, sa constatat că Nosema [ 13 , 57 , 58 ], virusul sacrobod [ 59 ] și Varroa [ 60 , 61 ] au determinat hrănirea precoce la albine. Din perspectivă finală, lucrătorii bolnavi sau afectați de sănătate au fost sugerați să beneficieze de a începe să se hrănească mai devreme ca o modalitate de a proteja alți indivizi din interiorul cuibului de a se infecta [ 58 ] sau de a profita la maximum de viața lor redusă [ 56 ]. În plus, ar fi posibil ca agentul bolii să beneficieze el însuși de un debut mai devreme de hrănire, dacă acest lucru a promovat transmiterea orizontală a acestuia la alte colonii gazdă [ 62 ]. Într-adevăr, în cazul DWV, o influență directă asupra comportamentului gazdei nu este puțin probabilă, având în vedere că particulele DWV au fost găsite anterior în corpurile de ciuperci - un centru cheie creier superior al acestor insecte [ 31 ] (dar vezi [ 34] ] pentru un studiu în care nu au fost identificate efecte comportamentale). Indiferent de aceste cauze posibile de adaptare, este clar că furajare precoce ar avea un efect major asupra coloniei de bine, ca culegătoare prematur depletes parțial populația doică de albine [ 63 ] și perturba diverse activități în interiorul stupului [ pe 64 - 66 la ] și maturizarea rapidă a comportamentului sa dovedit a accelera puternic eșecul coloniilor de albine stresate [ 63 ].

Dovezile puternice pe care le-am găsit pentru un efect indus de DWV asupra modelelor de mortalitate și a supraviețuirii pe termen lung au fost mai neașteptate. În mod tradițional, infecțiile secundare DWV la lucrătorii adulți sunt considerate "ascunse" și în mare parte asimptomatice [ 29 , 67 , 68 ], însă această propunere este în mod clar contestată de constatările noastre, care evidențiază efectele foarte clare și semnificative pe termen lung ale virusului. Deși mortalitatea crescută a fost înregistrată la albinele care prezintă simptome de infecție DWV evidentă și aripi infirmate [ 69 - 71 ], mortalitatea similară la albinele care au dobândit virusul în stadiul adult a fost demonstrată abia recent în albine experimentale cu câini și fără hrană [ 25 ]. Rezultatele noastre arată că acest efect de mortalitate continuă după debutul hrănirii și că virusul acționează astfel ca un factor de stres pe termen lung asupra sănătății albine și supraviețuirii. Motivitatea indusă de DWV ar putea avea mai multe cauze. Având în vedere că sa observat că DWV apare în creierul albinelor, inclusiv în corpurile de ciuperci [ 31 , 62 , 72 ] care sunt implicate în învățare și memorie și că infecțiile cu DWV s-au dovedit a induce deficite de învățare [ 30 ], este posibil ca mortalitatea crescută să fie cauzată de capacitățile de orientare insuficientă sau de evitarea prădătorilor sau că le face mai sensibile la alți factori de stres din mediu. Într-adevăr, tulpina Kakugo DWV sa descoperit mai devreme ca fiind asociată cu agresivitate sporită și comportament de asumare a riscului [ 73 , 74 ]. Alternativ, este posibil ca DWV să aibă drept rezultat o creștere a mortalității, de exemplu datorită unei reglementări costisitoare în sus a sistemului imunitar al gazdei [ 75 ]. Cu toate acestea, având în vedere efectul bine documentat asupra mortalității directe, a vieții timpurii, atât în ​​studiul nostru, cât și în cazul lui McMahon et al. [ 25 ], considerăm cel mai probabil un efect direct de mortalitate. Mai mult, și indiferent de cauzele care stau la baza, este clar că dispariția timpurie a albinelor infectate cu DWV și durata lor semnificativ mai scurtă de acțiune ar avea efecte dăunătoare asupra cantității totale de polen și hranire cu nectar efectuate de coloniile infectate. În plus, o perioadă mai scurtă de activitate a lucrătorilor ar determina, de asemenea, mai puțini lucrători să se angajeze în descoperirea de patch-uri noi, afectând astfel fluxul de informații și generând costuri sinergetice suplimentare pentru sănătatea coloniilor globale [ 47 ].

Faptul că în datele RFID, inocularea DWV nu a afectat durata călătoriei sau numărul de călătorii efectuate de foragerii infectați cu DWV s-au opus concluziilor [ 33 ], care au concluzionat că infecția DWV, dar nu Nosema ceranae, a redus durata medie a călătoriei. Întrucât a existat o variație semnificativă a impactului virusului asupra celor trei medii gazdă replicate, cu toate acestea, este posibil ca același efect să fi fost totuși detectat cu un număr mai mare de colonii donatoare și / sau gazdă replicate. Dat fiind faptul că albinele noastre donatoare au provenit dintr-o colonie unică, rară neinfectată, am avut a priori să nu ne așteptăm la nici o variație mare a impactului virusului. Motivele posibile pentru această variație ar putea fi legate de factorii sezonieri, de variația compatibilității genetice cu coloniile gazdă sau de diferențele subtile în performanța sau sănătatea coloniilor gazdă, cum ar fi posibila prezență a Nosema printre lucrătorii gazdă, pe care am făcut-o nu se uită explicit, dar se știe că provoacă hrănire precoce și afectează longevitatea, activitatea și performanța stupilor albinelor [ 13 , 45 , 58 , 76 , 77 ]. Alternativ, este posibil ca variația impactului DWV să fie legată de unele dintre albinele de control care s-au infectat în timpul etapelor ulterioare ale experimentului nostru, pe care rezultatele validării tratamentului sugerează că s-ar fi putut întâmpla (deși probabil la niveluri inferioare, figura 2 ) și că viteza la care a avut loc acest lucru a diferit în rândul coloniilor gazdă. Aceste rezultate sugerează de asemenea că o singură injecție dsRNA nu a fost suficientă pentru a proteja complet albinele pentru perioade lungi de timp și că administrarea orală continuă ar trebui utilizată pentru controlul eficient pe termen lung prin interferența ARN [ 49 , 50 , 78 ]. În ciuda acestei variații în efectul virusului, cu toate acestea, era clar că , în ansamblu, DWV a avut un efect puternic nociv în toate cele trei colonii, cu efecte semnificative asupra mortalitatii viata timpurie ( figura 4 a ), speranța de viață Forager ( figura 4 c ) și intervalul de activitate al forajului ( figura 4d ) în trei medii de colonii gazdă replicate și efecte semnificative asupra debutului furajării în două din cele trei colonii gazdă ( figura 4b ). Aceste constatări sunt în concordanță cu studiile care arată că DWV se numără printre cei mai importanți predictori implicați în declinul coloniilor de albine în Europa [ 14 , 16 , 17 , 24 ] și în Statele Unite [ 18 ] și, prin urmare, un factor important care contribuie la actuala criză de polenizare.

În ansamblu, rezultatele noastre evidențiază impactul stresorilor pe termen lung asupra sănătății și supraviețuirii albinelor, consolidând astfel concluziile mai multor studii recente de urmărire care au studiat schimbările induse de stres induse de albine [ 33 , 43 - 45 ], stresul nutrițional [ 36 ] sau expunerea la pesticide [ 9 , 11 , 35 , 37 - 40 ]. Sperăm că, în viitor, aceste abordări pot continua să fie utilizate pentru a ne ajuta să înțelegem mai bine factorii implicați în declinul polenizatorului în curs [ 1 - 5 ] și modul în care interacționează între ei în exercitarea stresului pe termen lung [ 2 , 5 - 10 ].