Polenul multor plante conține compuși secundari toxici, uneori în concentrații mai mari decât cele găsite în flori sau frunze. Semnificația ecologică a acestor compuși rămâne neclară, iar impactul lor asupra albinelor este în mare parte neexplorat. Aici, am studiat impactul alcaloizilor de pirolizidină (PA) găsiți în polenul Echium vulgare asupra adulților și larvelor albinelor. Echimidina, un PA prezent în E. vulgarepolen, a fost izolat și adăugat la dietele de albine pentru a efectua bioteste de toxicitate. În timp ce albinele adulte au prezentat toleranțe relativ ridicate la PA, larvele erau mult mai sensibile. Spre deosebire de alte albine, dieta larvară de albine conține, de obicei, doar urme de polen și constă predominant din secreții hipofaringiene și mandibulare produse de albinele asistentelor, care se hrănesc cu cantități mari de pâine de albine care conține polen. Am cuantificat transferul PA la secrețiile de asistență medicală produse de albine care au consumat anterior pâine de albine suplimentată cu PA. Concentrația PA în aceste secreții a fost redusă cu trei ordine de mărime în comparație cu conținutul de PA din dieta asistentei și a fost cu mult sub pragul de toxicitate pentru larve. Rezultatele noastre sugerează că asistența larală protejează larvele de albine de albine de efectul toxic al metaboliților secundari ai polenului.

1. Introducere

Pe parcursul evoluției, plantele au dezvoltat o gamă largă de aparate chimice împotriva herbivorilor [ 1 , 2 ], incluzând o diversitate impresionantă de metaboliți secundari. La rândul lor, erbivorele au răspuns cu numeroase adaptări, cum ar fi metabolismul enzimatic și sechestrarea toxinelor [ 3 ] . Albinele sunt un caz special printre erbivorele insectelor, deoarece nu consumă țesuturi foliare, ci se hrănesc exclusiv cu polenul și nectarul [ 4 ]. Deoarece metaboliții secundari nu se găsesc numai în frunze, dar sunt, de asemenea, prezenți în polen și nectar, albinele sunt expuse la o gamă largă de compuși potențial toxici. În special, polenul vegetal poate conține concentrații mari de compuși secundari [ 5 - 9 ]. Uneori, concentrațiile acestor compuși sunt mult mai mari în polen decât în ​​nectar [ 10 , 11 ]. Până în prezent, majoritatea studiilor pe această temă au explorat impactul compușilor secundari în nectar asupra albinelor și se cunoaște mult mai puțin despre modul în care consumul de compuși secundari de polen afectează supraviețuirea lor [ 12 ].

Calea compușilor secundari din polen în stupul de albine sugerează că atât albinele adulte cât și larvele sunt potențial expuse acestor compuși de polen ( figura 1 ). Albinele colectează polen dintr-o mare varietate de surse de polen [ 13 ], dintre care unele pot conține metaboliți secundari toxici. Albinele muncitorilor combină polenul cu mierea, nectarul și secrețiile glandulare și stochează acest lucru ca pâine de albine în stup [ 14 , 15 ]. Albine nou apărute consumă cantități mari de această păstură în primele zile de viață, așa cum este esențială pentru creșterea glandelor hipofaringe, in timp ce albinele asistenta matură se hrănesc cu pâine de albine pentru a produce secreții hipofaringelui și mandibulare [ 16 - 20 ], care este componenta principală a jeleurilor larvare [ 21 , 22 ]. Compoziția acestui jeleu depinde de faptul dacă larva devine o regină (jeleu regal), un lucrător (jeleu lucrător) sau o dronă (dulce), dar pentru primele 3-4 zile toate larvele primesc un jeleu care este liber sau aproape fără polen [ 23 , 24 ]. După această perioadă, larve lucrător primesc un jeleu modificat , care este mai puțin bogată în proteine și conține urme de polen [ 23 , de 25 - de 27 ]. Prin urmare, larvele de albine de miere consumă în mod direct numai cantități mici de polen care conțin metaboliți secundari, deoarece cea mai mare parte a dietei este compusă din jeleu care este secretat de albinele care alăptează. În contrast izbitor, larvele albinelor solitare și albinele se hrănesc cu un amestec de polen și nectar și, prin urmare, sunt expuse mai direct la metaboliții secundari ai polenului. Prin urmare, am emis ipoteza că producția de lapte care alăptează poate proteja larvele de albine împotriva expunerii la compușii secundari ai plantelor.

Figura 1.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 1.
Calea de metaboliți secundari din polenul E. vulgare în pâine de albine și diete larvare. Polenul E. vulgare care conține PA ca compuși secundari este recoltat de albine forager și depozitat în stup, ca pâine de albine, împreună cu alte tipuri de polen. Noile albine dezvoltate recent consumă pâinea de albine ca sursă de proteine ​​pentru dezvoltarea hipofaringienei. Albinele care alăptează mature consumă pâine de albine pentru a produce secreții hipofaringiene și mandibulare pentru a hrăni larvele.
Metaboliții secundari prezenți în polen pot afecta albinele în diferite moduri. Pentru unul, metaboliții toxici ai polenului pot influența supraviețuirea albinelor lucrătorilor nou-născuți și a albinelor mature, deoarece consumă cantități mari de pâine de albine. Acest lucru ar fi în concordanță cu un studiu anterior, care a sugerat că polenul de migdale ar putea fi toxic pentru albine dacă ar fi consumat exclusiv de către lucrători mai mult de o săptămână [ 8 ]. În al doilea rând, metaboliții secundari ai polenului pot influența în mod indirect larvele de albine, dacă acești compuși sunt transmiși din pâinea de albine în secrețiile de îngrijire medicală. Pentru a explora aceste posibilități, am folosit Echium vulgare ca model de plantă. Această plantă este larg răspândită în Europa, produce cantități abundente de nectar și polen floral și este vizitată în mare măsură de albine. Echium vulgare conține alcaloizii pirolizidina (AP) ca metaboliți secundari în multe țesuturi, inclusiv frunzele și polenul [ 7 , 11 , 28 - 30 ]. Concentrațiile deosebit de mari ale PA sunt găsite în polen, în timp ce concentrațiile PA în nectar sunt de aproximativ 500 de ori mai mici [ 11 ]. Astfel, conținutul ridicat de PA al polenului E. vulgare poate constitui un risc potențial pentru albinele albine.

În acest studiu, am extras PA din E. vulgare și am examinat efectul acestor compuși secundari asupra albinelor. În primul rând, am completat dietele pentru adulți cu PA în concentrații care corespundeau cantităților de PA natural găsite în polenul E. vulgare . Acest lucru ne-a permis să determinăm dacă metaboliții secundari pot afecta supraviețuirea adulților. În al doilea rând, am expus larve de albine de albine la dispoziții care conțin o gamă de concentrații de PA, care ne-au permis să determinăm dozele letale PA pentru larve. În al treilea rând, ne-am testat ipoteza că alăptarea larvară reduce substanțial expunerea larvelor albinelor la metaboliții secundari. Pentru aceasta, am cuantificat nivelele PA în secrețiile glandulare produse de asistente medicale care fuseseră hrănite anterior cu pâine de albine suplimentată cu PA. Dacă ipoteza noastră este validă, concentrațiile de PA din secreții vor fi sub doza letală pentru larve. În cele din urmă, studiul nostru oferă o înțelegere a riscului potențial pe care îl prezintă metaboliții secundari ai polenului pentru albine.

2. Material și metode

(a) Extracția și purificarea alcaloizilor de pirolizidină din E. vulgare

Polenul de E. vulgare conține cantități deosebit de mari de metaboliți secundari. Concentrațiile PA medii cuprinse între 0,9 și 24,5 mg g -1 au fost măsurate anterior în polenul E. vulgare [ 7 , 11 , 29 , 30 ]. În studiul nostru privind polenul E. vulgare colectat în Elveția, concentrațiile totale de PA au fost de obicei între 5,4 și 9,7 mg g -1 [ 11 ]. AP tipice prezente în polenul E. vulgare sunt N -oxid de echimidină și N -oxid de echivulgarină . Cu toate acestea, acești N- oxiduri PA sunt cel puțin parțial metabolizați în PA terțiar mai toxic în tractul digestiv al albinelor [ 31 ].

Am extras ecimidina și echivulgarina din frunzele și inflorescențele de E. vulgare colectate în diferite locații din Elveția (pentru detalii, consultați materialul suplimentar electronic). Pe scurt, materialul vegetal a fost liofilizat și extras în metanol (grad HPLC, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania), iar N- oxidurile au fost reduse cu praf de zinc în baze terțiare. După extracția lichid-lichid bazată pe acid, PA-urile terțiare s-au separat utilizând un sistem semipreparativ, s-au evaporat și s-au liofilizat. Am izolat 500 mg de echimidină la o puritate ridicată (94%), în timp ce am obținut mai puțin echivulgarină (25 mg, puritate 62%); aceste cantități reflectă concentrațiile naturale ale acestor PA în inflorescențele și frunzele de E. vulgare [ 28 ]. Cantitatea de echimidină a fost suficientă pentru toate biotestele prezentate în acest studiu (efecte asupra adulților, larvelor și transferului în jeleu regal). Cu toate acestea, deoarece cantitatea de echivulgarină nu a fost suficientă pentru a efectua toate cele trei bioteste, am decis să includem această PA numai în biotestele pe larve (a se vedea materialul suplimentar electronic).

(b) Toxicitatea echimidinei pentru albinele adulte

Am hranit lucrătorii nou-născuți de albine cu polen suplimentat cu echimidină pentru a examina efectul compușilor secundari ai plantelor asupra adulților cu albine.

Coloniile de albine ( Apis mellifera ) au fost amplasate la Centrul de Cercetare al albinelor din Elveția, la Agroscope, Bern, Elveția (46 ° 55'49 "N, 7 ° 25'9" E). Toate coloniile au fost tratate pentru infestarea cu Varroa și au fost testate negativ pentru puietul european greu. Pentru fiecare serie de teste, au fost selectate cadre care găzduiesc păsări emergente din trei colonii diferite de albine și incubate la 35 ° C în cuști de cadre. După 24 de ore, albinele nou-apărute au fost colectate într-un recipient de sticlă, amestecate delicat pentru a obține o populație omogenă și distribuite în mod egal în cuștile de depozitare Liebefeld [ 18 ] din oțel inoxidabil (13 × 6 × 10 cm).

Am colectat 5 kg de polen fără PA în cursul lunii aprilie 2015 pe care l-am folosit ulterior pentru a pregăti provizii suplimentate cu echimidină. Activitățile de încărcare a polenului au fost colectate zilnic de la patru colonii de albine și depozitate imediat la -25 ° C. Absența PA-urilor peste limita de detecție (LOD) de 0,7 μg g- 1 a fost confirmată prin analiza UHPLC-HRMS (a se vedea §2e). Mai mult, analiza melisopalinologică a arătat că nu există polen de la E. vulgare . O miere poliflorală recoltată la sfârșitul lunii mai 2015 (înainte de perioada de înflorire a lui E. vulgare ) a fost utilizată pentru prepararea rezervelor de polen suplimentar pentru a masca efectul de respingere al PA. În total, patru preparate artificiale au fost preparate prin amestecarea a 2,25 g de polen colectat de albine cu 1,00 g de miere. La acest amestec de polen / miere s-au adăugat echimidină 0,5 mg, 5 mg sau 25 mg în 62,5 pl de acetonă; aceasta a produs provizii cu concentrații de echimidină de 0,15 mg g- 1 , 1,53 mg g- 1 și , respectiv, 7,69 mg g- 1 . Dispoziția de control conține 62,5 pl de acetonă. Aceste concentrații au corespuns dozelor de 2, 20 și 100 μg de albină -1 , respectiv, presupunând că toate cele 50 de albine dintr-o cușcă au consumat aceeași cantitate de provizii. Prelevarea polenului cu cea mai mare concentrație de echimidină (7,69 mg g -1 ) a reflectat conținutul natural de PA al polenului E. vulgare [ 7 , 11 ], în timp ce rezerva de 1,53 mg g -1 a reflectat hrănirea cu polenul E. vulgare cu un nivel relativ scăzut Conținut de PA [ 29 , 30 ] sau surse mixte de polen.

Cantitatea de polen consumată de 50 de albine în primele 6 zile după apariție a fost de aproximativ 0,65 g, ceea ce reprezintă 13 mg pe albină. Alicote de 0,65 g din dispoziții au fost oferite la 50 de albine pe cușcă în ziua 0. Sucroză soluție (50:50, greutate / greutate) a fost furnizată ad libitum și înlocuită la fiecare 3 zile. Colivii au fost plasați într-un incubator setat la o temperatură de 30 ° C și o umiditate relativă de 75% (RH). Merele albine au fost scoase și numărate zilnic. Experimentul a fost oprit după ce toate albinele au murit. Pentru fiecare experiment, seriile de testare și de control au fost efectuate în triplicat. În plus, întregul experiment a fost repetat de trei ori (aproximativ 450 de albine pe punct de date).

(c) Toxicitatea ecimidinei pentru larvele de albine

Am examinat efectul echimidinei la o serie de concentrații asupra dezvoltării larvelor albinelor.

Larvele de primul instar au fost obținute din trei colonii de albine în 2015 și în 2016. În fiecare colonie, un pieptene cu celule goale a fost plasat într-o cușcă de excludere a reginei. Trei zile mai târziu, regina fiecărei colonii a fost închisă în cușca de excludere a reginei pentru 24 de ore. Ovipoziția a fost confirmată prin inspecție vizuală după eliberarea reginei. După 3 zile, larvele de primul instar au fost colectate cu o pensulă de vopsea dezinfectată 3/0.

Animalele de înmulțire A, B sau C conținând cantități variabile de zaharuri, extract de drojdie și jeleu regal au fost preparate conform metodei lui Aupinel și colab . [ 32 ]. Zaharurile ( d (+) - glucoză anhidră și d (-) - fructoză, Merck, Darmstadt, Germania) și extract de drojdie (Becton, Dickinson and Company, Allschwil, Elveția) au fost dizolvate în apă MilliQ. Soluțiile au fost filtrate printr-un filtru de acetat de celuloză cu ochiuri de 0,2 um (Hahnemuehle, Dassel, Germania) și combinate cu jeleu regal (a se vedea detaliile din tabelul 1 ) produse anterior în Centrul de Cercetare Elvețiană. Echimidina a fost dizolvată în acetonă (SupraSolv, Merck, Darmstadt, Germania) și suplimentată la concentrații egale în dietele A, B și C ( tabelul 2 ). Dietele au fost măsurate în volume și concentrațiile de echimidină au fost ajustate pentru a corecta creșterea densității din dieta de larve de la A la C (pentru detalii, a se vedea tabelul 2 ). Pentru controlul negativ, s-au adăugat 10 μl de acetonă la dietă. În total s-au preparat șase concentrații de echimidină (10 până la 80 pg g- 1 ) ( tabelul 2 ). Presupunând că fiecare larvă ar consuma întreaga dietă, doza cumulată de echimidină consumată per larvă a variat de la 1,8 până la 14,1 μg larva -1 (de asemenea, enumerată în tabelul 2 ).

Vizualizați în linie
tabelul 1
Compoziția dietelor utilizate în testele larvare.
Vizualizați în linie
Masa 2.
Concentrațiile de echimidină în diete și dozele cumulate de echimidină pentru larvele de albine.
O serie de teste de expunere cronică a fost efectuată pe larve în conformitate cu Aupinel și colab . [ 32 ], cu modificări minore. Celulele de altoire din polistiren (cod CNE / 3; Nicoplast Society, Maisod, Franța) pentru găzduirea larvelor au fost dezinfectate cu etanol 70% și uscate la 50 ° C. Celulele au fost apoi transferate în plăci de cultură de țesut cu 48 de godeuri (Greiner Bio-One; Frickenhausen, Germania), umplute anterior cu role dentare de bumbac (Ø 8 mm; Hartmann, Neuhausen, Elveția) înmuiate cu 500 pl de 13,2% glicerol (Merck, Darmstadt, Germania) în soluție de clorură de metilbenzetoniu 0,4% (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania). În ziua 1, larvele din stadiul I au fost grefate cu perii de vopsea (3/0) și plasate în celule conținând 10 μl de dietă A fără PA. Ulterior s-au adăugat încă 10 ui de dietă conținând PA, astfel încât concentrația PA finală să fie cea a dietei A. Plăcile de culturi de țesut conținând celulele au fost plasate într-o cameră de umiditate hermetică (Nalgene 5314-0120, Thermo Scientific) soluție de sulfat de potasiu (Emsure; Merck, Darmstadt, Germania) pentru a menține o RH de 95%. Camera a fost plasată într-un incubator de 34,5 ° C. În ziua 3, larvele au fost hrănite cu 20 pl de dietă B, în timp ce în ziua 4, ziua 5 și ziua 6, larvele au fost hrănite cu 30, 40 și, respectiv, 50 pl de dietă C. Larvele de mortalitate au fost monitorizate zilnic. Larvele moarte au fost aruncate și nu au fost înlocuite. Alimentele care nu au fost consumate în ziua 7 au fost îndepărtate înainte de transferarea celulelor de altoire într-o nouă placă de cultură sterilă. Ulterior, plăcile au fost ținute într-o cameră de umiditate conținând o soluție saturată de clorură de sodiu (Merck, Darmstadt, Germania) la 70% RH. În ziua 15, plăcile de cultură au fost plasate individual în recipiente de plastic, împreună cu o bucată de fagure, până când albinele au apărut.

(d) Urmărirea echimidinei din pâinea de albine în gelatina regală

În cele din urmă, am examinat dacă echimidina a fost transferată din pâine de albine în jeleu larvară. Pentru aceasta, am cuantificat nivelele de echimidină găsite în jeleul regal produs de asistente medicale care se hrăneau exclusiv pe pâinea de albine cu echimidină.

Pentru prepararea preparatelor de pâine de albine, am recoltat 400 g de pâine de albine fără PA în 2016. Peletele de pâine de albine au fost îndepărtate cu atenție de pe piepteni cu o spatulă metalică, asigurându-se că nu s-au colectat particule de ceară. Peletele au fost congelate la -20 ° C și apoi omogenizate cu o moară electrică. Absenta PA-urilor de peste LOD de 1,4 μg g- 1 a fost confirmata prin analiza UHPLC-HRMS (vezi §2e). Pentru adăugarea de PA, 120 mg de echimidină s-au dizolvat în 1 ml de acetonă și s-au amestecat cu 60 g de pâine de albine, rezultând o concentrație finală de echimidină de 2000 μg g- 1 . Ca martor, au fost amestecate 60 g de pâine de albine cu 1 ml de acetonă. Pentru producția de jeleu regal, este esențial să se asigure că albinele se hrănesc cu cantități mari de pâine de albine. Prin urmare, am folosit echimidina la o concentrație de 2000 μg g -1 , deoarece acest lucru este bine tolerat de albinele lucrătoare adulte. Spre deosebire de testul pentru adulți, nu am putut folosi mierea pentru a masca efectul respingător al echimidinei. Pe baza conținutului de PA cunoscut în polenul E. vulgare pur, colectat în Elveția [ 11 ], conținutul PA în pâinea de albine ar putea fi de două până la cinci ori mai mare dacă pâinea de albine este derivată exclusiv din polenul E. vulgare . Cu toate acestea, am folosit o concentrație PA care ar fi similară cu cea găsită într-o colonie de albine într-un mediu natural, deoarece albinele colectează în mod obișnuit polenul din numeroase specii de plante, iar polenul Echium se diluează în pâine de albine.

Am dezvoltat un sistem de stup modificat, în care albinele lucrătoare au fost într - un sistem închis și ar putea alimenta în mod exclusiv pe păstură suplimentat-echimidine: 600 g de albine (corespunzând 5000-6000 lucrătorilor; fără regină) au fost atent periat în mici MiniPlus ® urticarie , o unitate experimentală care replică comportamentul unei colonii de dimensiuni medii [ 33 ]. În total, s-au creat șase colonii: trei colonii experimentale și trei controale. Sistemele Miniplus au fost modificate astfel încât o cușcă externă (30 × 20 × 30 cm) cu laturi de lemn și acoperită cu o plasă metalică fină să fie înșurubată peste orificiul de intrare. Această cușcă externă a permis activitățile de curățare a albinelor, dar a împiedicat hrănirea și a forțat albinele care alăptează să se hrănească cu pâinea de albine și cu mierea plasată în interiorul sistemului stup. Un studiu preliminar a sugerat că 60 g de pâine de albine a fost suficientă pentru nevoile fiecărei colonii.

Coloniile experimentale au primit pâine de albine cu supliment de echimidină, în timp ce coloniile de control au primit pâine de albine fără supliment. Pentru fiecare colonie, 60 g de pâine de albine au fost lipite în celulele de ceară ale unui pieptene gol. Larvele din prima etapă au fost obținute din trei colonii de albine și altoite în celule plastice fixate la cadrele de regină. Rama care conține celulele plastice cu larve și pieptenele care găzduiesc pâinea de albine împreună cu un pieptene plin cu 500 g de miere de primăvară poliflorală și un pieptene plin cu apă au fost plasate în colonii fără regină într-un sistem Miniplus modificat descris mai sus. Coloniile au fost păstrate la temperatura ambiantă într-o cameră cu lumină naturală. După 3 zile, coloniile au fost transferate la 13 ° C timp de 3 ore înainte de colectarea celulelor care conțin gelatină regală. Capacele de ceară și larvele au fost îndepărtate din celulele care conțin jeleu regal. Celulele cu jeleu regal au fost detașate de la cadavrul de creștere a reginei și au fost depozitate la -20 ° C. Celulele noi, care găzduiesc larve noi grefate, au fost lipite de cadrele de regină și au fost plasate înapoi în colonie pentru producerea unui nou lot de jeleu regal. Procedura a fost repetată la fiecare 3 zile pentru un total de trei recolte pe colonie. Pâinea de albine rămasă după cele trei recolte a fost cântărită pentru a calcula cantitatea de pâine de albine consumată pe colonie. Experimentul a fost repetat independent de trei ori, de fiecare dată cu o colonie experimentală și de control.

(e) Cuantificarea echimidinei în jeleu regal, pâine de albine și polen colectat de albine, utilizând analiza UHPLC-HRMS

Pentru prepararea probelor de polen colectat de albine, s-a amestecat 1 mg de polen cu 100 pl de solvent de extracție A (metanol 70%, apă ultrapură 29,5% și acid formic 0,5%, v / v) și s-a transferat într-un eppendorf de 2 ml tub. Au fost adăugate cinci perle de sticlă (Ø 2 mm; Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) și tubul a fost agitat la 30 Hz timp de 4 minute. După centrifugare (18400 g , 4 minute), 5 pl din supernatant s-au transferat într-o fiolă de sticlă și s-au diluat de 10 ori cu solventul de extracție.

Pentru prepararea probelor de pâine de albine, s-au amestecat 10 mg de pâine de albine cu 1000 pl de solvent de extracție A și s-au transferat într-un tub Eppendorf de 2 ml. Au fost adăugate cinci perle de sticlă și tubul a fost agitat la 30 Hz timp de 4 minute. După centrifugare (18400 g timp de 4 minute), 10 pl din supernatant s-au transferat într-un flacon de sticlă și s-au diluat de 20 de ori cu solventul de extracție.

Pentru prepararea probelor de jeleu regal, se cântăresc 100 mg de jeleu regal folosind o scală de microbalanță (Mettler Toledo), amestecată cu 1000 pl de solvent B de extracție (98% apă ultrapură și 2% acid formic, puritate 98%, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) și transferate într-un tub Eppendorf de 2 ml. S-au adăugat cinci perle de sticlă, iar tubul a fost agitat la 30 Hz timp de 4 minute. După centrifugare (18400 g timp de 4 minute), supernatantul a fost colectat și purificat pe un cartuș BondElute SCX SPE (1 ml, Agilent Technologies, USA). Cartușele au fost spălate cu 1 ml de metanol și condiționate cu 1 ml de solvent de extracție B. Probele au fost încărcate pe coloană și spălate cu solventul de extracție B. După uscare probele au fost eluate într-o fiolă de sticlă utilizând metanol amoniac [ 34 , 35 ] și s-a uscat la 40 ° C timp de 2 ore folosind un evaporator centrifugal (CentriVap, Labconco). Probele au fost apoi re-dizolvate în 500 pl dintr-o soluție metanolică 70% utilizând o baie ultrasonică.

Detectarea și cuantificarea PA-urilor în lăptișorul de matcă, pâinea de albine și polenul colectat de albine prin analiza UHPLC-HRMS au fost efectuate conform Lucchetti și colab . 2016 [ 11 ]. Pe scurt, analiza PA a fost efectuată pe o coloană Acquity BEH C18 (50 x 2,1 mm id, 1,7 pm dimensiune particule, Waters), utilizând un sistem Acquity UPLC ™ (Waters) cuplat la un spectrometru de masă Synapt G2 QTOF (Waters). Volumul injecției a fost de 1 pl. QTOF a fost operat în modul pozitiv prin electrospray pe un interval de masă de 50-600 Da. O soluție de leucină-encefalină la 400 ng ml- 1 a fost perfuzată pe parcursul analizei pentru a asigura o precizie de masă mare (mai mică de 2 ppm). PA au fost identificate pe baza timpilor lor de retenție, a fragmentării și caracteristicilor de masă exacte și a comparării cu literatura existentă [ 7 , 11 ] și baze de date (Dicționarul produselor naturale, CRC Press, SUA, versiunea 6.1 pe DVD) PA în Echium spp. Cuantificarea a fost efectuată prin calibrare externă utilizând standardul echimidine (puritate 94%) de la Phytolab (Vestenbergsgreuth, Germania). Răspunsurile liniare au fost obținute de la 5 la 4000 ng ml -1 . Pentru echimidină, limita de cuantificare (LOQ) a fost de 2 ng ml -1 (raportul semnal-zgomot (s / n) de 10) și LOD a fost de 0,7 ng ml -1 (s / n3). Aceasta corespunde LOD de 0,7, 1,4 și 0,0035 μg g- 1 în polen, pâine de albine și, respectiv, jeleu regal.

(f) Analize statistice

Analiza de supraviețuire a albinelor adulte a fost efectuată cu R v. 3.4.1 [ 36 ] folosind supraviețuirea [ 37 ] și pachetul coxme [ 38 ]. Datele au fost analizate folosind un model Cox cu efecte mixte [ 39 , 40 ], cu cele 36 de cuști, fiecare conținând aproximativ 50 de albine, incluse ca efecte aleatorii. Nu a fost aplicată nici o cenzurare, deoarece toate albinele au murit la sfârșitul experimentului și fiecare moarte a fost un singur eveniment. Testarea raportului de probabilitate a arătat că efectele aleatorii ale cuștilor au fost semnificative din punct de vedere statistic ( p <0,001). Analiza ANOVA a fost efectuată utilizând pachetul auto [ 41 ] pentru a identifica semnificația experimentului, iar concentrațiile de echimidină au fost modelate ca factori categorici. În cele din urmă, comparațiile pe perechi ale experimentelor și nivelelor de concentrație au fost realizate folosind contraste Tukey cu ajustarea cu un singur pas pentru testarea multiplă cu funcții ale pachetului multcomp [ 42 ].

Funcțiile de supraviețuire a larvelor au fost estimate utilizând estimatorul Kaplan-Meier [ 43 ]. Testele logaritmice în perechi au fost efectuate cu SPSS 11 (SPSS 2005) pentru Macintosh OS X. Larvele juvenile care și-au terminat dezvoltarea și au apărut ca adulți au fost considerate ca observații cenzurate. Comparațiile multiple s-au datorat aplicării corecției Bonferroni la un nivel de semnificație α = 0,05 utilizând opțiunea de analiză "pereche pentru fiecare strat".

Pentru estimarea dozei letale mediane (LD 50 ), montarea modelului a fost realizată cu ajutorul funcției generale de montare a modelului drm al pachetului R (v. 3.3.2) drc [ 44 ] pentru analiza concentrației / dozei / efectului de timp / răspunsului date. LD 50 a fost calculat utilizând o funcție logistică logaritmică cu trei parametri, cu limita inferioară stabilită la 0. Pentru detalii, consultați materialul suplimentar electronic: funcțiile de montare a modelului pentru estimarea dozei mediane de echimidină letală (LD 50 ).

3. Rezultate

(a) Toxicitatea ecimidinei pentru albinele adulte

Pentru a evalua riscul de mortalitate al albinelor adulte după ce au consumat metaboliți secundari din polen, am testat efectul echimidinei completate în prevederile de polen asupra adulților nou apăruți. Controalele sau dispozițiile care conțin 2 μg, 20 μg sau 100 μg echimidină pe albină au fost consumate în decurs de 6 zile. Durata maximă de viață a albinelor în testele noastre a fost de 63 de zile. Micul mortalitate a fost observată în primele 15 zile pentru toate concentrațiile și controalele de echimidină testate. Astfel, nu a fost observată toxicitate acută de ecimidină. Cu toate acestea, durata de viață a adulților alimentați cu dispoziții de echimidină la 100 μg de albină -1 a fost redusă comparativ cu durata de viață a albinelor hrănite cu dispoziții de control sau cu dispoziții la 2 sau 20 μg albină -1 ( figura 2 ). Efectul dozei de 100 μg de albină -1 a fost semnificativ diferit de cel al martorului ( p <0,001, ajustat pentru teste multiple) sau doze mai mici de 2 sau 20 μg de albină -1 ( p <0,02), în timp ce dozele de 2 sau 20 μg de albine -1 nu au prezentat diferențe semnificative între ele ( p > 0,8) sau în comparație cu martorul ( p > 0,3). Astfel, ecimidina a avut un efect asupra supraviețuirii adulților la o doză de 100 μg albină -1 .

Figura 2.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 2.
Toxicitatea ecimidinei pentru albinele adulte. Curba de supraviețuire reprezintă grupul martor ( n = 459), albinele alimentate cu echimidină la 2 μg albină -1 ( n = 451), 20 μg albină -1 ( n = 455) și 100 μg albină -1 ( n = 448). Rezultatele pentru fiecare concentrație sunt raportate ca valori medii ale a trei experimente. Pentru fiecare experiment s-au efectuat serii de testare și de control în triplicat. Literele de la capătul curbelor indică diferențe semnificative între grupurile de tratament (comparații pe perechi ale mijloacelor, p <0,02).
(b) Toxicitatea echimidinei pentru larvele de albine

Pentru a evalua efectele metaboliților secundari ai polenului asupra larvelor de albine de albine, s-a efectuat o serie de teste de expunere cronică folosind diete suplimentate cu șase concentrații diferite de echimidină. Micile mortalități au fost observate în ziua 1 până în ziua 3 pentru toate concentrațiile de testat de echimidină. Când larvele au fost expuse la o doză cumulată de 14,1 μg echimidină per larvă, toate larvele au murit în decurs de 9 zile ( figura 3 ). Echimidina la o concentrație de 5,3 μg larva -1 a indus o rată a mortalității de 97% până la etapa imago, în timp ce 50% dintre larvele alimentate cu o doză cumulată de echimidină de 3,5 μg au terminat metamorfoza și apoi au apărut ca adulți ( figura 3 ). Nu s-au observat diferențe semnificative în ceea ce privește supraviețuirea până la etapa imago între starea de control și dieta la o doză cumulată de 2,6 μg larva -1 ( α = 0,05, test log-rank pereche, Bonferroni corectat, α * = 0,0024) sau doze mai mici . Ratele de apariție au fost de 73% (control), 76% (1,8 μg larva -1 ) și 74% (2,6 μg larva -1 ). Doza letală mediană (LD 50 ) înregistrată în ziua 21 (apariția la adult) [ 45 ] a fost de 3,81 μg. În concluzie, dozele de echimidină de la 3,5 până la 14,1 μg larva -1 au prezentat o toxicitate semnificativă asociată dozei la larvele de albine, în timp ce doza de 2,6 μg larva -1 , care corespunde unei concentrații de echimidină de 15 μg pe gram de dietă, mortal. Testele de expunere cronică s-au repetat cu echimidina disponibilă comercial de la Phytolab și au furnizat rezultate comparabile (material suplimentar electronic, figura S1).

Figura 3.
Descărcați cifra
Deschideți în fila nouă
Descărcați powerpoint
Figura 3.
Toxicitatea echimidinei pentru larve. Curbele de supraviețuire reprezintă larvele de control ( n = 288), larvele hrănite cu echimidine la concentrații de 1,8 pg larvă -1 ( n = 190), 2,6 pg larvă -1 ( n = 96), 3,5 pg larvă -1 ( n = 144 ), 5,3 μg larva -1 ( n = 96), 7,1 μg larva -1 ( n = 216) și 14,1 μg larva -1 ( n = 96). Biotestele au fost terminate în ziua 21, după ce albinele au apărut ca adulți. Literele de la capătul curbelor indică diferențe semnificative între grupurile de tratament (teste log-rank pereche, Bonferroni corectate, α * = 0,0024). Au fost efectuate cel puțin două serii de teste independente pentru fiecare concentrație. Curbele de supraviețuire arată valorile mediane.
(c) Transferul de echimidină din pâinea de albine în jeleu regal

Pentru a determina dacă metaboliții secundari ai polenului sunt transferați din pâinea de albine în jeleu regal, am măsurat nivelele de echimidină din jeleu regal produs de albinele care au consumat pâine de albine suplimentată cu 2000 μg echimidină pe gram de pâine de albine. Concentrațiile de echimidină din jeleul regal colectate din trei recolte independente au fost în medie de 3,8, 2,0 și respectiv 0,6 μg g -1 ( tabelul 3 ), în timp ce concentrațiile de echimidină în gelatina regală a coloniilor martor au fost sub LOD de 0,0035 μg g -1 . Concentrațiile echimidine măsurate în lăptișor au fost sub 15 ug g -1 , care este o concentrație echimidine dietetice care nu este letală pentru larvele de albine ( figura 3 ).

Vizualizați în linie
Tabelul 3.
Concentrația de echimidină în jeleu regal produs de albinele care alăptează. A
Coloniile experimentale au consumat în medie 35,4 ± 20,9 g de pâine de albine și colonii de control 41,8 ± 15,1 g de pâine de albine. Albinele de îngrijire a coloniilor experimentale au produs în medie 299 ± 102 mg de jeleu regal per celulă și albinele de colonii de control au produs 261 ± 77 mg de jeleu regal per celulă.

4. Discutie

Rezultatele noastre indică faptul că PA-urile au afectat supraviețuirea atât a adulților, cât și a larvelor, dar larvele au prezentat o sensibilitate mult mai mare la PA decât la adulți. Cu toate acestea, hrănirea cu secreții glandulare protejează larvele de expunerea excesivă la astfel de toxine, deoarece numai o mică parte din PA-urile de polenă a fost transmisă în hrana larvară. Din cunostintele noastre, studiul nostru este primul care arata ca asistenta larvara depaseste proprietatile toxice ale polenului de plante.

Polenul este o sursă aproape exclusivă de proteine ​​pentru lucrătorii cu albine [ 13 ]. În consecință, impactul compușilor secundari de polen este potențial important pentru lucrătorii nou-înființați, care se hrănesc cu cantități mari de pâine de albine pentru dezvoltarea glandelor hipofaringiene. Studiul nostru arată că echimidina (7,7 mg g -1 , 100 μg albină -1 ), atunci când este furnizată la o concentrație care reflectă conținutul total de PA din polenul E. vulgare pur în natură [ 11 ], a scurtat durata de viață a noilor albine nou apărute , în timp ce concentrațiile mai scăzute (1,5 mg g- 1 polen, 20 μg albine -1 sau inferioare) nu au afectat longevitatea. În mediul natural, acest efect poate să nu fie relevant pentru coloniile de albine, deoarece albinele colectează de obicei polenul din numeroase specii de plante [ 13 ] pe care le amestecă și păstrează ca pâine de albine. În consecință, la stupii de albine se așteaptă ca polenul care conține PA să fie diluat cu polen netoxic. În plus, concentrațiile mari de PA pot avea un efect disuasiv asupra albinelor [ 31 , 46 ] și un astfel de efect disuasiv poate reduce în continuare expunerea adulților la toxinele de polen. Toleranța relativ ridicată a lucrătorilor cu albine la PA este în concordanță cu rezultatele unui studiu anterior în care albinele adulte au fost hrănite cu soluții de zaharoză care conțin monocrotalină și un amestec de PA izolate din Senecio vernalis și nu a fost observată toxicitate acută în 48 de ore la PA niveluri mai mici sau egale cu 50 μg albină -1 [ 31 ].

Contrar albinelor adulte, larvele erau extrem de sensibile la PA. Efectele letale au fost observate la un LD 50 de 3,81 μg per larvă pentru echimidină. Efectele similare asupra larvelor s-au observat, de asemenea, pentru echivulgarină (LD 50 de 12,53 μg, material suplimentar electronic, figura S2 și tabelul S1), o PA deosebit de abundentă în polenul E. vulgare , care arată că echimidina și echivulgarina sunt atât toxice pentru larve la concentrații comparabile . În cadrul stupului de albine, cu toate acestea, larvele de albine de albine sunt abia expuse la polen, deoarece principala sursă de proteine ​​pentru larve este secreția glandulară bogată în proteine ​​a albinelor asistente. Studiile anterioare au estimat că cantitatea de polen consumată de larvele lucrătorilor până la etapa imago corespunde numai la 5% din întreaga cantitate de proteină consumată de o larvă de albine [ 24 ]. În mod remarcabil, dieta larvară a albinelor nu conține polen sau numai urme de polen în primele 3 zile de dezvoltare [ 23 , 24 ], când larvele sunt, conform studiului nostru, mai sensibile la PA decât la etapele ulterioare de dezvoltare material suplimentar, figura S3).

Consumul de polen poate avea în continuare implicații importante pentru dezvoltarea larvelor, dacă PA-urile prezente în pâinea de albine au fost transmise în secreții glandulare pentru hrănirea larvelor. Experimentul nostru final arată că concentrația PA în gelatina roșie a fost redusă cu aproximativ trei ordine de mărime în comparație cu concentrația PA care a fost suplimentată în pâinea de albine. Acest lucru indică faptul că numai o mică parte din PA-urile de polen prezente în pâinea albină consumată trece în larbul de larve. Interesant, concentrația medie de echimidină (2,1 μg g -1 ) măsurată în gelatina roșie ( tabelul 3 ) a fost semnificativ mai mică decât concentrația dietei (15 μg g- 1 ) care sa dovedit a fi neletală pentru larve ( figura 3 , tabelul 2 ). Luate împreună, concluziile arată că coloniile de albine într-un mediu natural sunt afectate de compușii secundari ai polenului E. vulgare doar într-o mică măsură, deoarece dieta larvară conține polen remarcabil de mic și doar o mică parte din PA sunt transmise de la albine pâine în secrețiile de îngrijire medicală.

Evoluția glandelor producătoare de alimente în albinele eusociale a fost sugerată anterior pentru a avea mai multe beneficii. În primul rând, hrănirea glandulară permite o maturare mai rapidă a larvelor decât o dietă cu polen și, prin urmare, dezvoltarea substanțial mai rapidă a coloniilor [ 47 ]. În al doilea rând, jeleul de larvă este cel puțin 90% digerabil, iar larvele hrănite cu secreții glandulare produc mai puțin fecale decât larvele hrănite cu polen. Cantitatea redusă de materii fecale scade nevoia de operațiuni de curățare a albinelor lucrătorilor și este probabil mai bună în privința igienei în celulele puietului [ 47 ]. În al treilea rând, secrețiile glandulare au proprietăți antimicrobiene și, prin urmare, reduc riscul de infecții larvare [ 48 ]. În al patrulea rând, propunem ca asistența larală să protejeze albinele de proprietățile toxice ale polenului și, prin urmare, le permite să utilizeze spectrul larg de polen, care este tipic albinelor [ 13 ].

Rezultatele noastre au, de asemenea, implicații importante pentru înțelegerea noastră cu privire la utilizarea polenului de către albine. Spre deosebire de albine, larvele de albine solitare și de albine consumă în mod direct provizii de polen și nectar și, prin urmare, sunt expuse direct la compușii secundari ai polenului. Testele noastre de toxicitate asupra larvelor albinelor de albine demonstrează că compușii secundari ai polenului au potențialul de a supraviețui larvelor puternic. Aceste rezultate sunt în concordanță cu studiile anterioare, care arată că proviziile de polen Echium pot fi toxice pentru larvele de albine solitare [ 49 , 50 ] și un studiu recent privind efectul alcaloizilor de polen de Lupinus asupra dezvoltării coloniilor de albine [ 9 ]. Un număr tot mai mare de studii asupra albinelor solitare sugerează de asemenea că multe proprietăți tipuri de polen prezintă care împiedică dezvoltarea larvară la polen non-gazdă [ 49 , 51 la - 54 la ].

În cele din urmă, în timp ce studiul nostru sa concentrat pe metaboliții secundari ai plantelor, merită menționat că alte substanțe chimice prezente în polen, în special pesticide, pot urma un traseu similar de la flori la pâine de albine și de acolo în secreții glandulare. Orientările actuale ale OCDE privind testarea pesticidelor asupra albinelor înainte de adoptarea legislației se concentrează asupra toxicității muncitorilor și a larvelor, fără a se analiza dacă acești compuși sunt transmiși în larvele larvare [ 45 ]. Prin urmare, sistemul nostru experimental poate servi ca model pentru evaluarea tipurilor de substanțe chimice care trec în dieta larvală și, prin urmare, substanțele chimice la care sunt expuse larvele de albine.

Accesibilitatea datelor

Materialul suplimentar electronic, figura S1 prezintă toxicitatea ecimidinei comerciale pentru larve. Materialul suplimentar electronic, figura S2 prezintă toxicitatea echivulgarinei pentru larve. Materialul suplimentar electronic, figura S3, demonstrează că larvele sunt cele mai sensibile la PA în timpul primelor 3 zile de dezvoltare (compararea toxicității ecimidinei pentru larve, atunci când este prevăzută în ziua 1 sau în ziua 3). Materialul electronic suplimentar, tabelul S1 enumeră concentrațiile de echivulgarină testate în diete și dozele cumulative de echivulgarină pentru larvele de albine. În plus, funcțiile de montare a modelului pentru estimarea dozei mediane de echimidină letală și a dozei de echivulgarină (LD 50 ) sunt furnizate în materialul suplimentar electronic. În cele din urmă, metoda utilizată pentru extracția și purificarea echimidinei și echivulgarinei din E. vulgare este de asemenea încărcată ca material suplimentar electronic.